微生物鉴定——法规解析
Q1：什么是微生物鉴定？
A1：微生物鉴定是指借助现有的分类系统，通过对未知微生物的特征测定，对其进行细菌、酵母菌和霉菌大类的区分，或属、种及菌株水平确定的过程，它是药品微生物检验中的重要环节。
Q2：药品生产为什么要进行微生物鉴定？
A2：从法规上来说，微生物鉴定对于药品生产是必须的。
《中华人民共和国药典》（下称《药典》）通则相应章节中对检出微生物的鉴定做了明确规定，如“非无菌产品的微生物检查：控制菌检査（通则1106） ” 中选择培养基或指示培养基上发现的疑似菌落需进行鉴定；对“无菌检查法（通则1101）” 的阳性实验结果中分离的微生物进行鉴定，以判定试验是否重试；“药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则（通则9205） ” 中建议对洁净室和其他受控环境分离到的微生物进行鉴定，以掌握环境微生物污染情况，有助于污染调查。此外，在药品生产中，有时亦需对药物原料、辅料、制药用水、生产环境、中间产物和终产品中检出的微生物进行适当水平的鉴定。
此外，《药典》中也建议对受控环境收集到的微生物进行适当水平的鉴定（通则9205），微生物菌群信息有助于预期常见菌群，并有助于评估清洁或消毒规程、方法、清洁剂或消毒剂及微生物监测方法的有效性，尤其当超过监测限度时，微生物鉴定信息有助于污染源的调査。关键区域分离到的菌落应先于非关键区域进行鉴定。微生物鉴定参照微生物鉴定指导原则（通则9204）进行。
Q3：药典中对微生物鉴定需要达到的水平是怎么规定的？
A3：微生物鉴定需达到的水平视情况而定，包括种、属鉴定和菌株分型。大多数非无菌药品生产过程和部分无菌生产环境的风险评估中，对所检出微生物的常规特征包括菌落形态学、细胞形态学（杆状、球状、细胞群、孢子形成模式等）、革兰染色或其他染色法、及某些能够给出鉴定结论的关键生化反应（如氧化酶、过氧化氢酶和凝固酶反应)进行分析，一般即可满足需要；
非无菌产品的控制菌检査一般应达到种属的水平；无菌试验结果阳性和无菌生产模拟工艺（如培养基灌装）失败时，对检出的微生物鉴定至少达到种属水平，必要时需达到菌株水平。
Q4：什么是微生物限度标准？
A4：说到药品生产中的微生物鉴定，就不得不提出另外一个概念：微生物限度标准。
药品生产中的微生物限度标准是用来衡量药品的活微生物数是否超出规定限度，它是控制药品质量的重要指标之一，药品染菌程度直接影响其内在质量。药品被微生物污染，其有效成分会遭到破坏，从而失去有效性，如各种含糖制剂经污染菌氧化或发酵而分解，pH值被改变等。药品被污染后还可能产生毒素。
在2015版的《中华人民共和国药典》（下称《中国药典》）中，也明确提出了对非无菌药物的微生物限度标准。在该标准中，对不同的药品种类均给出相应的微生物限度及控制菌种类，因此微生物限度和微生物鉴定是息息相关的。
Q5：《药典》中对非无菌药品微生物限度要求是多少？
A5：在现行的2015版《药典》中，分别对以下非无菌药品种类作出了规定：
1、化学药品制剂、生物制品制剂、不含药材原粉的中药制剂；
2、含药材原粉的中药制剂；
3、药用原料及辅料；
4、中药提取物及中药饮片。
Q6：药品生产企业为什么要进行自检？
A6：我国《药品生产质量管理规范》（下称GMP）第三百零六条提出，质量管理部门应当定期组织对企业进行自检，监控本规范的实施情况，评估企业是否符合本规范要求，并提出必要的纠正和预防措施。
从2005年开始，为强化监督，国家食品药品监督局开始对药品生产企业实行飞行检查，对不符合药品GMP检查评定标准的，收回其相应剂型的《药品GMP证书》，并由省级药品监督部门按照《药品管理法》第七十九条规定依法进行处罚，同时在国家食品药品监督局站上予以通报。
Q7：什么是飞行检查（飞检）？
A7：药品飞行检查，是指食品药品监督管理部门针对药品研制、生产、经营、使用等环节开展的不预先告知的监督检查，具有突击性、独立性、高效性等特点。也就是突击检查。
Q8：如果药品生产未按照GMP规定生产将会有怎样的后果？
A8：《药品管理法》第七十八条规定，药品的生产企业、经营企业、药物非临床安全性评价研究机构、药物临床试验机构未按照规定实施《药品生产质量管理规范》、《药品经营质量管理规范》、药物非临床研究质量管理规范、药物临床试验质量管理规范的，给予警告，责令限期改正；逾期不改正的，责令停产、停业整顿，并处五千元以上二万元以下的罚款；情节严重的，吊销《药品生产许可证》、《药品经营许可证》和药物临床试验机构的资格。
Q9：如被收回GMP证书，对药品生产企业会有什么影响？
A9：药品生产企业如因造假、违规生产等原因被收回GMP证书后，在整改期间相关药品责令暂停生产，召回在销药品。
可以看到，关于药企中微生物鉴定的必要性是一环扣一环的。如果一家药企没有按照GMP规定的在日常生产过程中对生产环境、生产原料以及药品成品等进行微生物限度的自检，或对检出菌没有进行药典规定的鉴定检验，那么当遇到食药监飞检不合格后则有可能会被收回药品GMP证书，影响药品的生产销售，并面临着停业整顿和罚款的风险。
因此，日常生产中的微生物鉴定对于药企来说是非常重要的。
而《药典》在通则9204中也对微生物鉴定流程也作出了规定：
（这里小编只为大家提取出部分要点，大家有兴趣的话可以自行在药典第四部通则9204“微生物鉴定指导原则”中查找了解）
1、待检菌的分离纯化
微生物鉴定的第一步是待检培养物的分离纯化，以获取待检菌的纯培养物（单个菌落），必要时可进一步进行纯培养，为表型鉴定和随后的鉴定程序提供足够量菌体。
2、初筛试验
常规的微生物鉴定，一般要先进行初筛试验确定待检菌的基本微生物特征，将待检菌做初步分类。常见的初筛试验包括革兰染色、芽孢染色、镜检观察染色结果和细胞形态、重要的生化反应等。
初筛试验可为评估提供有价值的信息。对于微生物鉴定方法来说，初筛试验是最关键的一步，若给出了错误的结果，将影响后续试验，包括微生物鉴定试剂盒和引物的选用。
革兰氏染色
3、表型微生物鉴定
表型微生物鉴定依据表型特征的表达来区分不同微生物间的差异，是经典的微生物分类鉴定法，以微生物细胞的形态和习性表型为主要指标。
4、基因型微生物鉴定
与表型特征不同，基因型鉴定是通过检测微生物保守序列，如16SrRNA序列和18SrRNA序列，在分子上水平上区分不同的微生物。
